一、志贺氏菌的生物学特性
志贺菌属(Shigella)是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌,通称痢疾杆菌,属肠杆菌科,革兰阴性无芽孢杆菌,无动力,无荚膜、无鞭毛、有菌毛,在营养培养基上生长良好。志贺菌常寄居在人及较高等猿类的肠道里,根据宿主的健康状况和年龄,一般只要10个菌体以上就能使人致病,其致病因素主要是侵袭力(菌毛)菌体内毒素以及个别菌株产生的外毒素。食品接触人员个人卫生差、从事食品加工行业人员患病或带菌者污染食品、存放已污染的食品温度不适当等是食源性志贺菌流行的最主要原因。

志贺菌属共有A、B、C、D四个亚群,分别是痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋氏志贺菌,结合生化和血清上的各个特征可以区别四个亚群。A群主要由不发酵甘露醇的菌组成(有些菌株例外),其他三个亚群的菌都发酵甘露醇。B群中的菌在血清学上有内在联系,C群中的菌彼此之间或与其他亚群血清上是无关的,D群中的菌培养几天后一般能发酵乳糖和蔗糖。





二、检验步骤



三、样品处理及增菌
3.1样品的处理
以无菌操作取样25g（mL）加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质容器中，常用均质容器有均质杯、锥形瓶、均质袋。
均质杯：多用于不易溶解的固体样品均质，可将固体样品切割搅拌均匀；
均质袋：可置于拍击式均质器中均质固体，常用于液体的均质；
锥形瓶：可置于摇床中，常用于液体的均质。
3.2增菌
均质后的样品置于41.5℃±1℃，厌氧培养16h-20h。厌氧培养可使用厌氧培养箱、厌氧培养盒和厌氧培养袋等， 志贺氏菌在志贺氏增菌肉汤中生长浑浊。

四、志贺氏菌的分离
取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD 琼脂平板和MAC 琼脂平板或志贺氏显色培养基平板上，于36℃ ±1℃需氧培养20h-24h。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h 再进行观察。
4.1 XLD 琼脂平板
志贺氏菌在XLD 琼脂平板上的菌落特征为粉色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐菌落。志贺氏菌大多不发酵木糖、乳糖和蔗糖，可与发酵此三种糖类的细菌（如大肠黄色菌落）区分；志贺氏菌不产硫化氢，可与产硫化氢的细菌（如大部分沙门等）区分。
4.2 MAC 或志贺显色培养基
志贺氏菌在MAC 琼脂平板上的菌落特征为无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐菌落。志贺氏菌大多不发酵乳糖产碱，故菌落颜色为红色，可与发酵乳糖产酸（菌落颜色为黄色，或有胆盐沉淀环）的细菌区分。部分宋内志贺氏菌迟缓发酵糖，若培养时间过长会产生粉色菌落，混淆结果。



五、初步生化试验
自上述选择性平板上分别挑取2 个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂（TSI）、半固体和营养琼脂斜面一管，置于36℃ ±1℃需氧培养20h-24h。
5.1 三糖铁琼脂
志贺氏菌在三糖铁琼脂TSI 中：
①斜面产碱呈红色且底层产酸呈黄色（发酵葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖）；
②不产气（福氏志贺氏菌6 型可产生少量气体）；
③不产硫化氢。



附录A

志贺氏菌增菌肉汤验证

1、产品用途：用于志贺氏菌的选择性分离和初步鉴别。
2、检验原理：胰蛋白胨提供氮源，葡萄糖提供碳源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂；吐温80 是中和剂；新生霉素可抑制革兰氏阳性菌生长。









4、验证结果小结：
4.1 生长率：目标菌福氏志贺氏菌 CMCC（B）51572+ 金黄色葡萄球菌 ATCC6538，逗点、L 品牌、H 品牌均满足国标在XLD 上＞ 10CFU,
无色至粉红色，半透明菌落的要求；
4.2 选择性：金黄色葡萄球菌 ATCC6538，逗点、L 品牌、H 品牌均符合国标在TSA 上＜ 100CFU 要求；
4.3 感观：感观：逗点、L 品牌、H 品牌外观颜色无明显差异。

附录B

木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD) 验证

1. 产品用途：用于沙门氏菌、志贺氏菌的分离培养。
2. 检验原理：酵母膏粉提供氮源、维生素、生长因子； 氯化钠维持均衡的渗透压；木塘、乳糖、蔗糖为可发酵糖类，产酸使酚红指示剂变黄；去氧胆酸钠抑制革兰氏阳性菌，但不影响沙门氏菌的生长；硫代硫酸钠可被某些细菌还原硫化氢，与柠檬酸铁铵中的铁盐生成黑色硫化铁；琼脂是培养基的凝固剂；酚红为pH 指示剂。









4、验证结果小结：
4.1 生长率：目标菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、福氏志贺氏菌 CMCC(B)51572 ，逗点、L 品牌、H 品牌均满足国标PR ≥ 0.7 的要求。H品牌菌落生长速度更快，菌落特征更明显，L 品牌生长速度较缓慢；
4.2 选择性：大肠埃希氏菌 ATCC 25922 ，逗点、L 品牌均满足国标G ＜ 5 的要求，H 品牌G=5.5 ，不满足国标要求；金黄色葡萄球菌ATCC6538，逗点、L 品牌、H 品牌均满足国标G ≤ 1 的要求；
4.3 感观：三家平板颜色无显著差异。
4.4 生长性能，逗点和H 品牌优于L 品牌。特异性上（特别是对大肠的抑制）L 品牌更好。

附录C

麦康凯琼脂（MAC）验证

1. 产品用途：用于志贺氏菌的选择性分离
2. 检验原理：蛋白胨提供碳氮源；乳糖为可发酵的糖类；3 号胆盐和结晶紫可抑制革兰氏阳性菌的生长；氯化钠维持均衡的渗透压；中性红是pH 指示剂，细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色，并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。琼脂是培养基的凝固剂。



表7-3 ：麦康凯琼脂（MAC）验证







4、验证结果小结：
4.1 生长率：目标菌大肠埃希氏菌ATCC25922，逗点、L 品牌、H 品牌均满足国标PR ≥ 0.5 的要求，H 品牌、L 品牌有明显胆酸盐沉淀，目标菌落较大，逗点无胆酸盐沉淀，标菌落较小； 福氏志贺氏菌 CMCC(B)51572，逗点、品牌、H 品牌均满足国标PR ≥ 0.5 的要求。
4.2 选择性：金黄色葡萄球菌 ATCC6538 ，逗点、品牌、H 品牌均满足国标G ≤ 1 的要求。
4.3 感观：三家平板颜色无显著差异。

附录D

志贺氏菌显色培养基验证

1. 产品用途：用于志贺氏菌的选择性分离和初步鉴别。
2. 检验原理：蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素；氯化钠可维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；抑制剂抑制杂菌的生长；酚红是pH 指示剂，发酵糖产酸的菌呈黄色；混合色素对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团。



表7-4 ：志贺氏菌显色培养基验证





4、验证结果小结：
4.1 生长率：目标菌福氏志贺氏菌 CMCC(B)51572、痢疾志贺氏菌 CMCC(B)51105 逗点、H 品牌均满足国标PR ≥ 0.5 的要求。H 品牌菌落
生长速度更快；
4.2 选择性：逗点、H 品牌金黄色葡萄球菌 ATCC 6538，逗点、H 品牌均满足国标G ≤ 1 的要求；
4.3 特异性：产气肠杆菌 ATCC13048、痢疾志贺氏菌 CMCC(B)51105 逗点、H 品牌均满足菌落颜色特征要求。
4.4 感观：两家平板颜色无显著差异。
4.5 2 家产品无明显差异，都满足国标。

附录E

三糖铁琼脂(TSI)验证

1、产品用途：用于鉴别肠道菌发酵蔗糖、乳糖、葡萄糖及产生硫化氢的生化反应。
2、检验原理：胨、牛肉浸出粉提供氮源、维生素、矿物质；乳糖、葡萄糖、蔗糖为可发酵糖类，其产酸时通过酚磺酞指示剂测出，酸性呈黄色，碱性呈红色；硫代硫酸钠可被某些细菌还原为硫化氢，与硫酸亚铁中的铁盐生成黑色硫化铁；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。







4、验证结果小结：
4.1生化特性：目标菌大肠埃希氏菌ATCC25922、肠炎沙门氏菌CMCC（B）50335、福氏志贺氏菌ATCC12022、铜绿假单胞菌ATCC27853生长特性均符合国标要求；
4.2感观：逗点、L品牌、H品牌空白管无明显差异。
4.3三家产品无明显差别，在肠炎沙门氏菌上，L品牌更优秀-黑色菌更明显。